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Title:
杨树NAC基因家族分析
Author: 祁广
Degree Level: 博士
Issued Date: 2012-06
Degree Grantor: 中国科学院研究生院
Place of Degree Grantor: 北京
Supervisor: 周功克
Keyword: 杨树 ; NAC ; 进化 ; PdCSLD5 ; PdCSLD6 ; 纤维素
Subject: 生物资源::能源植物资源
Major: 生物化学与分子生物学
Abstract: NAC蛋白是植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育过程。本研究杨树(Populus trichocarpa)为研究对象,对NAC基因家族进行系统分析,共鉴定163NAC基因家族成员,进化分析显示这些基因被聚类成18个亚家族。结果表明,这些NAC的基因结构和基序组成在亚家族之间具有保守型,有120NAC基因分布在19个连锁群上,8773%)个基因定位杨树基因组的复制区段并且在进化过程中被保留。EST频率和生物芯片分析发现,大部分的杨树NAC基因表达都有时空特异性,但大部分复制基因的表达模式则部分冗余,说明这些基因在进化过程中发生了亚功能化。利用实时定量PCR分析25个候选基因,其表达特异性与预测结果一致。基于NAC基因的基因组分布,推测大片段重复对杨树NAC基因家族的扩增起主要作用。通过对NAC基因进行系统的表达谱分析,发现了NAC家族成员的功能分化。另外,大片段重复发生以后,基因表达模式差异表明杨树NAC基因通过亚功能化被保留下来。我们的结果为进一步功能鉴定杨树NAC基因以及分析NAC基因结构与功能的关系奠定了基础。纤维素对根毛顶端细胞壁的完整性起主要作用,但目前对根毛形成过程中根毛顶端的纤维素生物合成相关基因研究甚少。以前的研究表明,拟南芥AtCSLD3参与根毛形成,可能参与纤维素或者类似纤维素的β-葡聚糖的生物合成,为此我们进一步研究其功能并分析鉴定它在杨树中的同源基因。对杨树30个),拟南芥29个)和水稻34个)CSL基因家族成员进行生物信息学分析,发现杨树PdCSLD5PdCSLD6AtCSLD3位于同一分支上,蛋白序列比对分析发现PdCSLD5PdCSLD6AtCSLD3具有非常高的同源性(86%进一步对AtCSLD3PdCSLD5PdCSLD6基因结构分析表明它们都含有三个外显子两个内含子。推测PdCSLD5PdCSLD6可能是AtCSLD3的功能同源基因。通过实时定量PCRGUS组织化学染色分析发现,PdCSLD5PdCSLD6基因在所有组织器官中均有表达,但是在根部特别是根毛的表达量最高。亚细胞定位分析发现PdCSLD5PdCSLD6定位于根毛顶端的质膜,在非根毛细胞中,PdCSLD5PdCSLD6定位于高尔基体。同时,PdCSLD5PdCSLD6的定位受到活性氧的调控。分别克隆PdCSLD5PdCSLD6基因并构建过表达整体,然后分别互补拟南芥atcsld3突变体。结果显示,PdCSLD6完全互补拟南芥atcsld3突变体的根毛缺陷表型,而PdCSLD5则部分互补atcsld3突变体表型。细胞壁单糖组成分析表明拟南芥atcsld3突变体中葡萄糖残基含量明显上升,纤维素含量分析表明拟南芥atcsld3突变体的纤维素含量明显降低,并且这些细胞壁糖组分的变化可以被PdCSLD6基因的表达恢复至野生型的水平。多糖免疫定位分析发现, CCRC-M1CCRC-M87CCRC-M38LM10(分别检测木葡聚糖同型半乳糖醛酸聚糖和木聚糖四种抗体荧光信号强度在不同的拟南芥株系没有明显差异,表明AtCSLD3PdCSLD6可能与上述多糖的生物合成无关使用CBM3aCBM17抗体分别检测纤维素和非结晶化β-葡聚糖)分析时,野生型相比,CBM3aatcsld3突变体的荧光信号明显减弱,相反,CBM17荧光信号atcsld3突变体明显增强,表明在atcsld3细胞壁中纤维素成分显著降低,同时非结晶化的β-葡聚糖成分明显升高PdCSLD6互补的atcsld3转基因植株中CBM3a CBM17荧光信号均恢复到野生型水平,但在PdCSLD6过表达植株中CBM17的荧光信号较野生型有显著增强,说明在PdCSLD6过表达植株中,非结晶化β-葡聚糖成分明显提高。以上结果证明PdCSLD6AtCSLD3与纤维素生物合成,同时表明它们是功能同源基因
English Abstract: NAC domain proteins are plant-specific transcriptional factors known to play diverse roles in various plant developmental processes. However, no comprehensive study incorporating phylogeny, chromosomal location, gene structure, conserved motifs, and expression profiling analysis has been presented thus far for the model tree species Populus.In the present study, a comprehensive analysis of NAC gene family in Populus was performed. A total of 163 full-length NAC genes were identified in Populus, and they were phylogeneticly clustered into 18 distinct subfamilies. The gene structure and motif compositions were considerably conserved among the subfamilies. The distributions of 120 Populus NAC genes were non-random across the 19 linkage groups (LGs), and 87 genes (73%) were preferentially retained duplicates that located in both duplicated regions. The majority of NACs showed specific temporal and spatial expression patterns based on EST frequency and microarray data analyses. However, the expression patterns of a majority of duplicate genes were partially redundant, suggesting the occurrence of subfunctionalization during subsequent evolutionary process. Furthermore, quantitative real-time RT-PCR (RT-qPCR) was performed to confirm the tissue-specific expression patterns of 25 NAC genes.Based on the genomic organizations, we can conclude that segmental duplications contribute significantly to the expansion of Populus NAC gene family. The comprehensive expression profiles analysis provides first insights into the functional divergence among members in NAC gene family. In addition, the high divergence rate of expression patterns after segmental duplications indicates that NAC genes in Populus are likewise to have been retained by substantial subfunctionalization. Taken together, our results presented here would be helpful in laying the foundation for functional characterization of NAC gene family and further gaining an understanding of the structure-function relationship between these family members.Cellulose is required for the cell wall integrity of root hair growing tips, but little is known about the genes involved in cellulose synthesis during root-hair morphogenesis. AtCSLD3 has been shown to be essential for root hair formation and cellulose biosynthesis during root hair morphogenesisHere we characterized two poplar cellulose synthase-like (CSL) genes, PdCSLD5 and PdCSLD6, the closest orthologs to AtCSLD3. A phylogenetic tree was constructed from alignments of 30 poplar, 34 Rice and 29 Arabidopsis CSL protein sequences, and PdCSLD5 and PdCSLD6 were placed in a monophyletic clade with AtCSLD3. PdCSLD5 and PdCSLD6 both exhibit 86% similarity to AtCSLD3. The gene structure analysis revealed that PdCSLD5 and PdCSLD6, along with AtCSLD3, have similar intron/exon organizations, including three exons and two intronsExpression analysis showed PdCSLD5 and PdCSLD6 expressed in every organ with highest transcript level in roots. Subcellular localization analysis showed PdCSLD5 and PdCSLD6 were located in the apical plasma membranes of growing root hairs and in Golgi of the non-root hair forming cells. Furthermore, the localization pattern can be rewhen treated with reactive oxygen species (ROS) Expression of PdCSLD5 or PdCSLD6 in atcsld3 was able to partially or completely rescue the root-hair defects caused by the disruption of AtCSLD3, respectively. Cell wall sugar composition analysis showed increased glucose content and the decreased crystalline cellulose content of the cell wall preparation in the atcsld3 mutantImmunolocalization analysis using the monoclonal antibodies CCRC-M1CCRC-M87CCRC-M38 and LM10 that recognize xyloglucan, homogalacturonan and xylan, respectively, recealed no significant difference of the fluorescent signals between the different Arabidopsis lines, indicating that PdCSLD6 and AtCSLD3 may not be involved in biosynthesis of polysaccharides mentioned above. Analysis with CBM3a and CBM17 that recognize crystalline cellulose and noncrystalline β-1,4-glucan, respectively showed increased noncrystalline β-1,4-glucan and decreased crystalline cellulose content in atcsld3, as well as the increased noncrystalline β-1,4-glucan in the PdCSLD6-overexpressed lines. All these changes in the cell wall sugar composition could be restored to the wild type level by expression of PdCSLD6 in atcsld3 mutant. Taken together, our results demonstrate that PdCSLD5 and PdCSLD6 are functional orthologs of AtCSLD3, and may participate in the crystalline cellulose synthesis during root-hair formation.
Language: 中文
Department: 能源植物资源
Available Date: 2013-07-13
Content Type: 学位论文
URI: http://ir.qibebt.ac.cn/handle/337004/1506
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祁广博士:杨树NAC基因家族分析及PdCSLD5和PdCSLD6基因功能研究.pdf(5255KB)学位论文--开放获取View Download

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祁广. 杨树NAC基因家族分析[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2012.
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