QIBEBT-IR  > 单细胞中心组群
以微拟球藻为模式的微藻产油功能基因组学研究
李敬
导师徐健
2013-06
学位授予单位中国科学院研究生院
学位授予地点北京
学位专业生物化学与分子生物学
关键词生物燃料 微拟球藻 功能基因组学 脂组 基因组 转录组 模式体系
其他摘要产油微藻作为未来液体燃料来源的优势在于光合效率高、生物质产量大、产油效率高、环境适应性强、固碳效果显著、油脂品质高、可综合利用,因此微藻液体燃料具有解决我国能源短缺、CO2减排与环境治理的巨大潜力。然而,优良藻种是微藻能源产业的关键之一。自然界缺乏集中高效光合作用、高生物量累积率、高油脂积累、高环境耐受性等核心性状于一体的优良藻种。产油微藻的认识和改造,必须从全基因组调控网络的解析与改造入手。对产油微藻全基因组调控网络系统、深入的解析与改造首先要求一个有一定代表意义的研究模式体系。但是,当前国际范围内,针对高产油微藻,在全基因组等组学(Omics)水平和系统生物学角度,尚无成熟的、系统的研究模式(Research Models。因此,在现阶段,这一研究模式体系的确立和创建,是产油微藻种质资源研究的首要挑战之一。Nannochloropsis生态分布广泛,在全球藻种库中已具备丰富的藻株资源,进化地位独特,是单细胞微藻中独立的一个属,具有诸多作为工业化生产的独特优势:生长迅速、抗逆能力强、大量积累TAG,同时可积累EPA、类胡萝卜素等高附加值产物。最近有研究团队在Nannochloropsis细胞上成功建立了基于同源重组的转化体系。可见,Nannochloropsis具备作为微藻产油新型细胞工厂模式生物的巨大潜力。在本研究中,我们将已在中国和以色列实现户外大规模培养的微拟球藻Nannochloropsis oceanica作为研究模式。首先,我们测序了N.oceanica IMET1的基因组DNA和不同条件下的cDNA以辅助基因注释。N.oceanica IMET1的核、叶绿体和线粒体基因组分别是31.36Mb117.5Kb38Kb,基因组总计31.5Mb,分别编码975412635个蛋白质基因。其中核基因组中有98.9%9649)的基因可被mRNA-Seq验证。N.oceanica IMET1基因组比较小但编码区比较长,平均内含子个数较少,相对比较紧凑。基于GO数据库对N.oceanica IMET1和模式绿藻衣藻Chlamydomonas reinhardtii进行功能注释,发现N.oceanica IMET1基因组比C.reinhardtii基因组含有更多的参与脂类以及逆境的基因。在脂类相关代谢中,包括甘油酯代谢、磷脂代谢、类异戊二烯代谢以及脂类修饰在内的4个亚类在N.oceanica IMET1基因组中得到显著性富集。一些与应激相关的过程如氧化应激、创伤应激以及冷应激也得到了富集。在N.oceanica IMET1基因组中,对脂类相关代谢以及应激反应相关途径的富集很可能奠定了N.oceanica IMET1作为高产油、高抗逆野生微藻的遗传基础,有助于其大规模开发。N.oceanica IMET1 TAG合成途径的重构发现,(i) 与基因组较大的衣藻相比,N.oceanica IMET1中脂类合成相关的基因有一个非常明显的扩张,如LC-FACSLPATDGATN.oceanica IMET1基因组编码13DGAT,包括2type-1 DGAT11type-2 DGAT基因,而在衣藻Chlamydomonas reinhardtii仅含有6DGAT(ii) DGAT基因进行进化分析发现,DGAT-1DGAT-2在初级内共生事件发生之前就已经分化开来,在起源上各具特色。(iii) 基因扩张仅仅局限于脂类代谢中的几个关键节点,其它基因的拷贝数则相对比较少,如脂肪酸合成中的MCATKARHADTAG装配中的GPAT,其它膜脂合成相关的酶,如半乳糖苷脂合成中的MGDDGD、硫脂合成中的SQD、甜菜碱脂合成中的BtaABtaB等。(iv) 除了基因复制之外,水平基因转移也有助于基因扩张增加基因的拷贝数。 其次,除了基因组之外,我们还在脂组以及转录组水平上探究N.oceanica IMET1高产油机制,通过不同时间间隔取样考察其动态性。通过高分辨率的LC/MS脂组分析,发现TAG的含量由<5mg/g干重)增至缺氮96h412mg/g干重),而极性甘油酯却由115mg/g干重)降至41mg/g干重),表明膜脂的循环使用对TAG的积累最大只贡献了其中18%的份额,这就排除了TAG全部来自于已有膜脂循环使用的可能性。因此,该研究表明,缺氮后,从从头合成途径将提供很大份额的TAG,而已有膜脂的降解所提供的份额则不是很大。而且,在转录组水平上,根据对差异表达基因设定的筛选标准,Illumina mRNA-Seq深度测序结果共挖掘出3,255个基因的转录丰度在这6个时间点上发生了差异表达,其中包括1,027个功能未知的基因。这些差异变化的基因根据表达模式分成16clusters,涉及胞内很多代谢途径。整合分析表明,碳流可能是通过增强C4-like的碳浓缩机制、糖酵解、蛋白质降解、PDHC/PDHC支路被推入进脂肪酸合成中提供前体,然后又通过上调TAG合成步骤中下游的基因包括TEACBPDGATLDSP的表达而被牵引进TAG,使得缺氮后TAG的主分为TAG 48:1 (16:0/16:1/16:0)TAG 50:1 (16:0/16:0/18:1)TAG 50:2 (16:0/16:1/18:1)TAG 50:2 (16:0/16:1/18:1)。而且,直接参与TAG合成的各个节点在基因剂量和转录动态上具有很大的异质性。比如,13DGATs在时空上协同工作将acyl-CoA牵引进TAGI型和II型脂肪酸合酶对于脂肪酸的合成都有贡献;TE的表达量提高,再加上持续性表达的ACBP,增加了脂肪酸从叶绿体到内质网的转运以维持acyl-CoA产量进行TAG的装配;不依赖于acyl-CoAPDAT在缺氮后48h才启动,应答则比较晚。相反,N.oceanica IMET1中的两个同质型ACCase在缺氮后没有出现上调,反应比较不活泼。定位到内质网以及叶绿体的两个GPAT的转录本都没有发生显著性变化,这可能是组成型表达,或者存在其它调控机制。关于N.oceanica IMET1的高产油机制我们提出了一个三重调控模式:层次一是将潜在的各种碳流推入(push)前体分子acetyl-CoA用于合成脂肪酸,这些节点持续性的工作,如C4-likeCCM机制以及PDHC途径/PDHC支路途经;层次二是脂肪酸合成以及甘油酯合成上游的限速基因比如ACCaseGPAT,它们负责产生合成脂肪酸和甘油酯的前体,在基因组上只有一个或两个拷贝,在转录水平上没有明显变化;分配脂肪酸/甘油酯前体合成各种脂类的调控主要发生在第三个层次上,层次三包括那些处于各合成途径下游的基因,它们的基因拷贝数比较多,在转录表达水平上也比较活跃,扮演着牵引pull前体分子进入合成途径的作用。在基因组上高拷贝数的、在转录水平上动态但协调性变化的DGATs特别是type-2DGATs,使得其可竞争性地将更多的脂肪酸/脂类前体分子牵引进TAG的合成中。最后,我们还根据转录组数据首次筛选出了377条件特异型的生物标记基因以及49时间阶段特异型的生物标记基因。利用它们从而可以潜在的实时准确地监控微拟球藻N.oceanica IMET1的产油过程。

综上所述,针对缺乏野生高产油微藻种质资源模式研究体系的科学瓶颈,本文将以Nannochloropsis oceanica IMET1作为研究对象,建立产油微藻的基因组、转录组、代谢物组等系统生物学模式研究体系,同时监测其在转录和代谢水平上的动态变化,全面深入地考察产油微藻能量转化与存储、环境耐受性等一系列复杂性状的网络调控机制,从而建立野生产油微藻的首个全基因组调控网络的功能基因组学研究模型。这些努力将直接指引通过代谢工程手段和合成生物学的思路改造和构建高综合素质的产油藻株,进而为微藻能源产业奠定优良的种质基础和遗传基础

; Microalgae represent a potential source of biomass feedstock for biofuels and biomaterials. Many microalgal species and strains possess the ability to grow rapidly, synthesize large amounts of lipids, particularly storage neutral lipids mainly in a form of triacylglycerol (TAG), and utilize non-arable land, non-potable water, and waste streams (e.g., flue gases and wastewaters), and thus impose little competition with food crops while providing environmental benefits. However, the genetic foundation of robust TAG production in microalgal feedstock suitable for large-scale photosynthetic cultivation remain largely unknown. Lack of model organisms for the genome-wide networks of microalgal oil-related genes further hampers rational trait-improvement. Nannochloropsis is a genus of unicellular photosynthetic microalgae in the class Eustigmatophyceae and widely distributed in marine, fresh and brackish waters. They are of industrial interest due to their ability to grow rapidly, synthesize large amounts of TAG and high-value polyunsaturated fatty acids (e.g. eicosapentaenoic acid), and tolerate broad environmental and culture conditions. Homologous recombination based gene transformation system recently established in Nannochloropsis should enable trait improvement for commerical applications. Here we focus on the robust strain Nannochloropsis oceanica IMET1 with high EPA and TAG content, which has been industrialized in China, Irazel etc.. We sequenced its genomic DNA and cDNA obtained from different growth conditions to aid in the annotation of genes. For strain IMET1, the nucleic, chloroplast and mitochondria genomes are 31.36Mb, 117.5Kb and 38Kb respectively, totaling 31.5Mb. Moreover, 9754, 126 and 35 protein-coding genes were predicted in the nuclear, chloroplast and mitochondrial genomes, respectively. Among the 9754 IMET1 nuclear genes, 98.9% (9649) were verified by RNA-Seq. Nannochloropsis genome features small size, high coding potential and small paralogous-groups. Number of proteins with gene ontology terms assigned as the subcategories of each biological process in Nannochloropsis genomes are counted and compared to the one in C.reinhardtii. There are relatively more proteins involved in lipid and carbohydrate metabolism as well as the response to stress in Nannochloropsis genomes than C.reinhardtii. Among lipid metabolism, the subcategories including glycerolipid metabolism, phospholipids metabolism, isoprenoid metabolism and the lipid modification are enriched. Some processes related to response to stimulus, including response to oxidative stress, wounding stress as well as cold stress are also enriched in Nannochloropsis, while the response to osmotic stress have less proteins involved. The enrichment of lipid related pathway and stress response related pathway likely underlie oleaginousness in large-scale cultivation.The ubiquitous enrichment of lipid metabolism related functional modules spur us to reconstruct the lipid biosynthesis pathway in Nannochloropsis. Genes encoding enzymes catalyzing fatty acid production from acetyl-CoA and TAG assembly are identified in IMET1, enabling us to investigate the underlying genetic structure of lipid biosynthetic pathway. (i) There’re prominent gene expansion in the pathway compared to the green algae Chlamydomonas (with a much larger genome). Genes with more copies in Nannocholoropsis include the ketoacyl ACP synthetase (KAS), the long chain fatty acid CoA synthase (LC-FACS), LPAT and DGAT. There’re 13 DGATs genes identified in each Nannochloropsis strain, including 2 DGAT-1 genes and 11 DGAT-2 genes, while there’re only six and four in Chlorophyta Chlamydomonas and another Heterokont diatom thalassiosira respectively, and even less in the other green lineage and Heterokonts. The prominence of DGATs as well as other lipid related genes in Nannochloropsis over the other currently available lineages constitutes the genetic foundation underlying the excellent capability to accumulate lipid. (ii) Nannochloropsis has recruited DGAT genes from multiple lineages and well maintained to forge an enormous TAG synthesis apparatus. The distinct gene organization pattern might be due to the strong positive selection between them. (iii)The gene expansion is not ubiquitous along the TAG pathway, but limited to the several crucial nodes, including ketoacyl-ACP synthase (KAS), long chain fatty acid CoA synthase (LC-FACS) and the last two acyl-transferase LPAT and DGAT. The other enzymes that have comparable (non-expanded) gene copies includes the MCAT, KAR, HAD in fatty acid biosynthesis, GPAT in TAG assembly, and other phospholipids biosynthesis related enzymes, such as the the MGD and DGDfor galactolipid synthesis, SQD for sulfolipid synthesis, BtaA and BtaB for betain lipid synthesis, EPT for phosphatidylthanolamine synthesis. (iv) In addition to gene duplication, lateral gene transfer events make great contribution in the gene expansion. Lateral gene transfer occurs ubiquitously in most of the lipid biosynthesis nodes with increased gene copy numbers. For example, three of the PA phosphoesterase (PAP) genes are possibly transferred from bacteria. In addition, the complete time-courses of triacylglycerol (TAG) synthesis under N-starvation induction and control conditions were also probed via a single-basepair-resolution transcriptomic program and the corresponding high-resolution lipidome profiles. The absolute increase in TAG (from less than 5µg/mg of dry weight to 412 µg/mg of dry weight at 96h) is much larger than the decrease of polar glycerolipids (from 115 to 41 µg/mg dry weight, i.e. about 18% of the overall TAG increase). Thus exclusive fatty acid recycling by degrading pre-existing membrane glycerolipids was not sufficient to account for the massive increase in TAG following nitrogen starvation. Therefore, de novo synthesis must have functioned substantially for accumulating the massive amount of TAG, besides a small portion of polar lipid recycling.Under N condition, the dramatic lipidome changes were accompanied by a dynamic transcriptomic program. One third of all genes (3,255) were differentially expressed between the two temporal series of transcriptomes (N/C) at any of the six timepoints, including 1,027 functionally unknown genes. These differentially expressed genes, based on temporal change pattern of N/C, formulated sixteen clusters.The integrative analysis revealed carbon is potentially being ‘pushed’ into fatty acid biosynthesis via elevated C4-like CCM, glycolysis, protein degradation, PDHC bypass/PDHC pathway, and then being ‘pulled’ by a large abundance of TAG synthesis activity at later steps including TE, ACBP, DGATs and LDSP, which together underpin global lipid-class shift from MGDG, DGDG, SQDG, PG, PI to TAG that the TAG with lower 5mg/g DW under Control condition was exaggerated quickly to 412.3mg/g over 4 days N-deprivation, especially enriched with the four major species TAG 48:1 (16:0/16:1/16:0), TAG 50:1 (16:0/16:0/18:1), TAG 50:2 (16:0/16:1/18:1) and TAG 50:2 (16:0/16:1/18:1). Interestingly, individual nodes directly underpinning TAG metabolism exhibited large heterogeneity in gene doze and transcript dynamics. For example, thirteen DGATs including type I and type II, worked in concert or in cascade, both spatially and temporally, to channel acyl-CoA to TAG. Moreover, both Type I and Type II FAS work to yield fatty acid following N-starvation; TE increased, concomitant with the ‘stay-on’ ACBP, presumably increasing the chloroplast-to-ER transport of fatty acids to maintain acyl-CoA pools for TAG assembly. The acyl-CoA-independent PDAT was induced at 48h as a late response to transfer the sn-2 acyl from PC to TAG, accelerating the TAG accumulating rate. On the opposite, the transcript of two monomeric ACCase showed no up-regulation following N-deprivation, functioning inertly. Both ER-targeting and plastidic GPAT exhibited little change in transcript abundance under N-starvation, which may be considered constitutively expressed and the enzyme pools stored in the cells may be adequate for coping with largely accumulating TAG, or may be regulated by other mechanisms. Furthermore, a three-tiered regulation of the TAG-production network is evident. Tier I involves these nodes such as C4-like CCM and PDHC bypass/PDHC pathway which push the carbon (mostly originated from CO2) into fatty acid biosynthesis; Tier II involves those rate-limiting genes in the upstream of fatty acid synthesis (such as ACCase), and glycerolipid synthesis (e.g.GPAT) that produce fatty acid and glycerol lipid precursors for various pathways leading to the formation of diverse classes of lipids, e.g., phospholipid, sphingolipid, glycolipid, and neutral lipids. These genes are less variable in both gene dose (with only one or two copies in the genome) and in transcriptional expression. The partitioning of fatty acid/glycerolipid precursors into individual lipid synthesis pathways is then largely regulated at the Tier-III level. Tier III involves those genes resident at the end of the individual pathways. It is the dose and transcriptional expression potential of these genes that determine the pulling power of precursors into their pathways. The copious dose and highly dynamic yet coordinated transcriptional expression of DGATs (particularly type-2 DGATs), along with the localization of DGATs in ER, chloroplast, and mitochondria (indicative of the presence of partial or complete TAG synthesis pathways in these organelles), provide competitive advantage over other glycerolipid synthesis pathways in pulling fatty acid/lipid precursors into TAG synthesis under stress conditions.The highly dynamic yet reproducible transcriptomic programs suggested transcript-based temporal signatures to characterize and track the oil production process. To test this hypothesis, we derived a ‘CN index’ based on the abundance of the 377 potential marker genes with over two-fold changes and they are able to significantly distinguish between N-stressed samples (oleaginous cells) and the control samples (nonoleaginous cells). Furthermore, from these ‘condition-specific’ markers, we developed a strategy to identify 49 “temporal” biomarkers to distinguish between the six timepoints sampled under each of the two conditions.The revolutions in whole-genome based technologies, coupled with systems biology, metabolic engineering and synthetic biology approaches, would enable the rational design and engineering of algal feedstock and help filling the gaps between the technical and economical reality and the enormous potential of algal biofuels.
作者部门功能基因组
学科领域功能基因组
公开日期2013-07-13
学位类型博士
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.qibebt.ac.cn/handle/337004/1499
专题单细胞中心组群
推荐引用方式
GB/T 7714
李敬. 以微拟球藻为模式的微藻产油功能基因组学研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2013.
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