QIBEBT-IR  > 工业生物燃气研究组
产氢绿藻的筛选、诱变及氢化酶的异源活性表达
张彦婷
导师郭荣波 研究员
2012-05
学位授予单位中国科学院研究生院
学位授予地点北京
学位专业生物化学与分子生物学
关键词Green Algae H2 Photoproduction Hydrogenase Ultraviolet Mutagenesis Heterologous Expression
其他摘要

绿藻光解水制氢是以太阳能为能源,以水为原料,通过藻细胞光合作用及其特有的[FeFe]氢化酶,将水分解为氢气和氧气,是目前生物制氢领域最具应用前景的研究方向之一。本论文作为绿藻产氢的基础性研究,主要工作集中在3个方面:绿藻光合产氢藻株筛选和产氢机理研究、高氧耐受性藻株诱变筛选和绿藻氢化酶异源表达体系的构建及氢化酶体外纯化研究。

通过对大量绿藻藻种进行氢化酶活性筛选,获得了一株之前未报道的具有氢化酶活性的海水绿藻青岛大扁藻(Platymonas  helgolandica var. tsingtaoensis,即Tetraselmis helgolandica var. tsingtaoensis),对其产氢特性及产氢机理进行了研究。结果表明,解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)胁迫条件下,青岛大扁藻光合产氢得到显著提高,经过24 h光照累积产氢量可达0.525 mmol/L,约为对照的260倍。产氢过程中PS II活性被完全抑制,淀粉含量不断下降,PS II抑制剂二氯苯二甲基脲(DCMU)对CCCP胁迫下的光合产氢无抑制作用,说明青岛大扁藻光合产氢所需电子主要来源于细胞内源底物代谢。值得注意的是,DCMUCCCP对青岛大扁藻光合产氢具有协同增强效应,使产氢量在CCCP胁迫的基础上提高了近1倍。 

为获得高氧耐受性产氢藻株,解决绿藻中可逆氢化酶对氧极为敏感的问题,以目前已知产氢活性最高的绿藻Chlamydomonas moewusii野生株作为出发藻株,通过紫外辐射,结合甲硝唑外加氧法进行高氧耐受性产氢突变株的诱变和筛选。得到了4株氧耐受性及产氢活性均显著提高的突变藻株Mu-1Mu-2Mu-3Mu-4,并对其进行了氢化酶体内活性、呼吸活性与PSII光化学活性分析。结果表明,4株突变藻株的氢化酶体内活性约为野生株的1.692.861.061.80倍,突变株经1%(体积分数)氧气处理后,残留活性分别从野生株的20.0%提高到34.4%32.5%55.6%43.1%。其中,突变藻株Mu-1Mu-2在生长过程中的光合作用与呼吸作用均未发现明显变化,说明突变发生在氢化酶基因上。 

为实现绿藻氢化酶的异源活性表达,首先通过RT-PCR克隆得到莱茵衣藻氢化酶hydA2Cr、小球藻氢化酶hydCf和斜生栅藻氢化酶hydSo,分别将其与丙酮丁醇梭菌成熟因子hydEhydFhydG共表达,构建得到3种氢化酶在大肠杆菌BL21(DE3)FTD147中的异源表达载体。通过培养基组成及诱导条件优化,实现了3种氢化酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源活性表达,而FTD147菌株不适用于表达绿藻氢化酶。通过SDS-PAGEWestern  blot检测表明,经过诱导后成熟因子已成为重组菌内主要蛋白组成部分,重组氢化酶约50%以可溶蛋白形式存在。利用六联组氨酸蛋白标签纯化得到重组小球藻氢化酶,其蛋白表达量约为5 mg/L。对重组蛋白的酶学性质研究表明,其酶学特性均与天然氢化酶或其它绿藻氢化酶性质相符。 

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H2 production by bidirectional [FeFe] hydrogenase in green algae is a perfect approach to H2 production by photohydrolysis using solar energy. It is currently receiving increased attention. As a basic study of H2 production by green algae, the main studies in this paper focued on exploiting green algae for H2 production and investigating mechanism of H2 metabolism, screening of O2-tolerance phenotypes in H2producing strains, construction of an efficient heterologous expression system for algal hydrogenases and purification of recombinant hydrogenase. 

By detection of hydrogenase activity in several green algae collected, a marine green alga, Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis (that is Tetraselmis helgolandica var. tsingtaoensis), was found to be capable of H2 productionfor the first time. Characterization of H2 photoproduction by the green alga and the mechanism of H2 metabolism were investigated. A significant improvement in H2 photoproduction was observed in P. helgolandica var. tsingtaoensis in the presence of the uncoupler carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). The CCCP addition to algal cultures led to a 260-fold increase in H2 production. The accumulated H2 yield was up to 0.525 mmol/L after 24 h illumination. The photosystem II (PS II) photochemical activity was shown to be completely inhibited by CCCP under illumination. During the CCCP-treated H2 production, the cellular starch content continuously decreased, and the addition of PS II inhibitor of herbicide 3-(3, 4-dichlorophenyl)-1, 1dimethylurea (DCMU) showed no negative effect. These results demonstrated that H2 production essentially depends on electrons donated to the hydrogenase by the endogenous substrate matabolism in CCCP-treated P. helgolandica var. tsingtaoensis. Interestingly, the added DCMU further resulted in almost double H2 yield in the CCCP-treated cultures. 

In order to reduce the sensitivity of hydrogenases in green algae to O2, four mutants of Chlamydononas moewusis trains with improved O2-tolerance and H2-evolving activities, namely Mu-1, Mu-2, Mu-3 and Mu-4, were generated via ultraviolet mutagenesis and were screened following an exposure to metronidazole and O2 . Then, the hydrogenases activity in vivo, the respiration activity and the PS II activity of algal cells were characterized for the screened strains . The results showed that the hydrogenase activities in vivo of the four mutants were respectively 1.69, 2.86, 1.06 and 1.80 times more than that of the wild type. The residual activities of the mutants after a treatment with 1% O 2 (volume fraction) increased respectively from the original 20.0 % to 34.4%, 32.5%, 55.6% and 43.1%. There were no obvious differences in photosynthesis and respiration during the growth of Mu-1, Mu-2 and the wild type. These results suggested that the observed O 2 -tolerant phenotypes in the two mutants might be attributed to the mutations present in the hydrogenase enzyme. 

The original genes of hydA2 Cr  from Chlamydomonas reinhardtii, hydA Cf from Chlorella fusca and hydA So from Scenedesmus obliquus were isolated by performing RT-PCR. The three [FeFe] hydrogenases expression systems were achieved in Escherchia coli BL21 (DE3) and FTD147 by coexpression of hydE, hydF, and hydG from the bacterium Clostridium acetobutylicum. After optimizing medium composition and induction conditions, the three hydrogenases were successfully heterologously expressed in E. coli BL21 (DE3). Howerer, E. coli FTD147 could not serve as a suitable host for expression of green algae hydrogenases. SDS–PAGE and western blot analysis confirmed the successful expression of the His-tagged proteins. After anaerobic incubation, the heterologous proteins had accumulated to become abundant proteins, and about half of the hydrogenases were produced as soluble form. The recombinant HydA from C. fusca was purified with a high yield of about 5 mg/L culture. The molecular characterization of purified hydrogenase was similar to the enzyme purified from native source. 

 

作者部门生物制氢与沼气团队
学科领域生物制氢与沼气
公开日期2012-11-13
学位类型博士
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.qibebt.ac.cn/handle/337004/1354
专题工业生物燃气研究组
推荐引用方式
GB/T 7714
张彦婷. 产氢绿藻的筛选、诱变及氢化酶的异源活性表达[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2012.
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